强致癌物质黄曲霉毒素M1检测方案

黄曲霉毒素主要存在于谷物、坚果、花生、棉籽粉、玉米、干辣椒粉等食品中以及一些与人类血液，动物饲料相关的产品中。霉菌的生长并不一定表明黄曲霉毒素的存在，因为黄曲霉毒素只有在湿度、温度适合及通风良好才会生成。黄曲霉毒素B类具有蓝色荧光，G类具有绿色荧光。除了蔬菜中常见的(B1,B2,G1,G2)，还有存在喂食了有毒饲料的奶牛的牛奶中的黄曲霉毒素M，其中毒性高的M的代谢物为4－羟基化的产物Bs.黄曲霉毒素M1是黄曲霉毒素B1的羟基化代谢产物，也是一种强致癌物质。其危害巨大，人类日常消费食品中如牛乳及其制品是易受到黄曲霉毒素M1污染的食品之一。黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时，可导致肝癌甚至死亡。毒性是As₂O₃的100倍其实主要是指黄曲霉毒素比As₂O₃毒。

目前来讲，Aflatoxin M1的检测方法有液相色谱法(HPLC)，酶联免疫检测法等。液相色谱法可以的检测奶制品中黄曲霉毒素的微小含量。而使用黄曲霉毒素M1 ELISA试剂盒则能够快速而准确的分析样品中黄曲霉毒素M1残留。

作为国内专业从事霉菌毒素检测技术与产品服务的主要供应商， 2010年泰乐祺科技投巨资成立了"检测应用实验室"，重点关注食品安全事件尤其是涉及霉菌毒素安全等检测技术问题，以期望快速提出解决方案。近期应针对奶中出现的黄曲霉毒素M1超标问题，泰乐祺科技提供了两种检测方案，可以帮助企业轻松应对奶中黄曲霉毒素M1的*检测。

液相色谱法：

根据国标《GB 5413.37—2010》食品安全国家标准乳和乳制品中黄曲霉毒素M1 的测定

　实验用前处理：

实验仪器和好耗材包括：

恒温水浴锅　溶剂过滤器(带真空泵)1000ml  高速匀质器 黄曲霉毒素免疫M1亲和柱玻璃纤维滤纸 玻璃注射器 无荧光特性玻璃试管 空气压力泵 超声波清洗机  定量滤纸 量筒 样品瓶 容量瓶 移液器或移液管

　　实验用试剂：色谱乙腈色谱甲醇 氢氧化钠 石油醚 超纯水或去离子水等等

HPLC条件：

样品取样：真菌毒素分析的大误差来源是样品的收集和取样过程，所以必需保证样品收集和取样具有代表性。

样品前处理：分不同样品

牛奶  水浴加热至40度，离心用上清液过柱净化；

乳粉和粉状婴幼儿配方食品：称取适量奶粉样品，用于蒸馏水中，混合均匀使其充分溶解，离心离心用上清液过柱净化；

发酵乳(包括固体状、半固体状和带果肉型)：称取适量奶粉样品，用于蒸馏水中，调节PH值至微碱性，高速均质器匀浆，水浴加热后离心，取上清液混合均匀使其充分溶解，离心离心用上清液过柱净化；

干酪：称取适量切细或粉碎，过筛用加纯水溶解，高速均质器匀浆，超声提取后收集上清液，然后用石油醚进行两次萃取，然后用适宜的有机溶液萃取，取若干上清液过柱净化

奶粉样品，用于蒸馏水溶解中，调节PH值至微碱性，水浴加热后离心，取上清液混合均匀使其充分溶解，离心离心用上清液过柱净化；

奶油：称取适量加甲醇水溶解，震荡后分页漏斗取下层溶液，蒸干后溶于水用于过柱净化。

免疫柱净化步骤：*符合GB/T 18980-2003

┅┅取出免疫亲和层析柱, 恢复至室温，将上方塞子取出斜剪断，再插回亲和柱上。

┅┅将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下。准确移取清澈液注入玻璃注射器；

┅┅将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约2-3mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2~3mL空气通过柱体；

┅┅更换玻璃注射器与亲和柱连接，在注射器中加入10ml水，调节压力使水以约6mL/min流速清洗亲和柱。

┅┅准确加入4mL色谱级乙腈洗脱，流速为1 mL/min ~2mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测。

注：收集管中的洗脱液即为纯化后的样品，可直接用ELISA,荧光和液相等方法检测。

HPLC 检测需要仪器与耗材

酶联免疫检测法：符合国家标准

酶联免疫检测法采用竞争ELISA，在微孔板上预包被黄曲霉毒素B1抗原，加入样本（或黄曲霉毒素M1标准品溶液）及辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素M1抗体。样本或标准品溶液中的黄曲霉毒素M1与预包被在板孔上的黄曲霉毒素M1抗原竞争结合辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素M1抗体。未结合的酶标抗体在洗涤时被除去。再加入TMB显色液，读取吸光值。样本的吸光值与其所含残留物黄曲霉毒素M1抗原的含量成负相关。对照标准曲线，即可得出相应残留物黄曲霉毒素M1的含量。

样品处理

牛奶 直接离心取上清液用于检测

奶粉及其他固状奶制品：需要溶解于去离子水中，离心取上清液用于检测

试剂盒检测时间：30分钟＋30分钟

交叉反应率：

ELISA 方法检测需要：

　　分析人员要求：

化学分析仪器及其相关专业或有液相色谱仪操作经验的人员。

注：作为面向提供霉菌毒素检测技术解决方案的主要服务商之一，PriboLab凭借强大的研发团队和霉菌毒素检测技术的研究，为农业生产、食品加工与粮食、饲料工业等行业提供专业的真菌毒素检测技术产品与技术服务。北京泰乐祺作为 PriboLab在中国的合作伙伴，积极为国内客户提供的霉菌毒素检测技术与产品服务，为国内客户提供适宜的霉菌毒素检测方案，帮助国内客户建立的霉菌毒素项目检测平台。