黄酒中圆弧偶氮酸Cyclopiazonic acid HPLC检测方案

一、背景介绍

黄酒是中国的民族特产，也称为米酒（ricewine），在世界三大酿造酒（黄酒、葡萄酒和啤酒）中占有重要的一席。酿酒技术独树一帜，成为东方酿造界的典型代表和楷模。近年来，有研究发现黄酒在发酵过程中不可避免会产生圆弧偶氮酸，这就要求必须对圆弧偶氮酸进行检验。

圆弧偶氮酸（Cyclopiazonic acid ,CPA）是曲霉属和青霉属的圆弧青霉的代谢产物，别名环匹阿尼酸。CPA是一种神经毒，可造成肝脏、肾脏和胃肠道损伤，体重下降、虚弱，出现食欲不振、腹泻、脱水、精神沉郁、角弓反张、抽搐等症状，能影响钙的吸收，降低蛋壳质量，影响种禽孵化，可在肉蛋奶中有残留。据报道，有人从食品和饲料中分离出大量青霉菌，从中鉴定出数十种真菌毒素，而其中多的就是CPA。它广泛存在花生、大豆等粮食作物中，往往与黄曲霉毒素同时存在，因此CPA的中毒往往被黄曲霉毒素中毒所掩盖。

目前环匹阿尼酸的检测方法包括：薄层色谱法（TLC）、液相色谱法（HPLC）等。其中，Zambonin、李业鹏等人用50μm CW/TPR作为萃取纤维,以HPLC-UV/DAD为分离检测手段,分别分析测定了奶酪中的圆弧偶氮酸,该方法的检测限为7ng/mL。但是相关的检测圆弧偶氮酸的国家标准尚未制定，也没有针对黄酒的圆弧偶氮酸检测的解决方案，为此普瑞邦推出了专门用于净化浓缩圆弧偶氮酸的多功能净化柱。该快速净化柱，是利用多机能吸附填料吸附取出霉菌毒素检测中的干扰峰的一类固相亲和柱，适用于HPLC液相检测谷物类、豆类、花生坚果类和黄酒中的圆弧偶氮酸的样品净化，净化步骤简单快捷，回收率高。

二、多功能净化柱-液相色谱法

1. 所需设备和耗材　　

液相色谱仪及色谱柱：真菌毒素色谱柱（PRC-18，Pribolab）。

多功能净化柱：PriboFast^® 230 环匹阿尼酸多功能净化柱(M2300，5ml，25支/盒，Pribolab)。

高速均质器：达到22000rpm 以上(EQ-WR-1L，Pribolab)。

玻璃纤维滤纸：PriboFast^®玻璃纤维滤纸（GMF-110，Pribolab）

标准品：圆弧偶氮酸/环匹阿尼酸（STD#8022，Pribolab）

2．样品前处理

2.1、量取25毫升黄酒，置入250毫升均质器或250毫升锥形瓶中。依次加入70毫升甲醇和10毫升6%的碳酸氢钠水。高速搅拌2分钟（均质器）或在摇床上摇动1小时。

2.2、将萃取液通过Whatman 4号滤纸或者玻璃纤维滤纸，然后，吸取50毫升的滤液到250毫升的分液漏斗中。加入100毫升己烷（脱脂提取物）轻轻混合避免乳化。

2.3、在两层分离后，小心将另一个分液漏斗收集水液层下的液体，添加50毫升的10% KCL水溶液。弃掉正己烷。以2毫升6N盐酸酸化后，加入CHCL₃ 50毫升，轻轻地混合，用250毫升的锥形瓶收集下面的有机层。

2.4、加入的50毫升CHCL₃采用重复方法提取，合并两次的CHCL₃提取物于锥形瓶内。添加50克无水硫酸钠盐（硫酸钠），静置1小时。

2.5、过滤萃取液并全部收集到200毫升的旋转蒸发瓶中,40ºC下蒸干。

3. 多功能净化柱净化

3.1、净化柱活化：将PriboFast 230 环匹阿尼酸多功能净化柱以15毫升CHCL₃过柱，控制大流速在3毫升/分钟，不要让柱干涸。

3.2、富集：用10毫升CHCL₃溶解旋转蒸发器瓶中干燥后的提取物，在大流速2毫升/分钟条件下过柱。

3.3、洗涤：不要让柱干涸。至全部溶液过柱后，开始洗涤柱子。以10毫升CHCL₃：丙酮（1 + 1）和10毫升CHCL₃：甲醇（95 + 5）从顶端洗柱后，以10毫升C₄H₁₀O继续洗涤。丢弃洗涤溶液。

3.4、洗脱CPA：用10毫升CHCL₃:甲醇（75:25）过柱洗脱，控制大流量为2毫升/分钟，使用合适的容器收集洗脱液（例如，20毫升的锥形试管，优选烷化硅）。

3.5、吹干：氮气或在真空40℃水浴中干燥蒸发洗脱液。

3.6、复溶：用1毫升的流动相溶解残渣。采用涡流混合30秒和超声波溶解标本。

4. 配制标准溶液和标准添加溶液

4.1、CPA贮存溶液：100μg/ml溶于甲醇。

4.2、工作标准：吸取100μL浓度为100μg/mlCPA标准溶液（10μgCPA）至琥珀色自动采样瓶中，溶解于0.9毫升的流动相中。相对应的浓度是10μg/ml。

5. HPLC条件